Modele facture dz
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Modele lettre demande de disponibilité fonction publique
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Modele jacquard lapin

Validation des changements d`expression génique à l`aide de PCR en temps réel. Le numéro d`unité montrant les niveaux relatifs d`ARNm dans chaque échantillon a été déterminé comme une valeur de mRNA normalisée par rapport à peptidylprolyl isomérase a (PPIA). Les données RT-PCR ont été analysées en utilisant la méthode 2 − ΔΔCT comme décrit dans (36). Les résultats des analyses quantitatives de PCR en temps réel montrées dans chaque panel ont été normalisés par rapport à la valeur la plus faible fixée à 1. Les barres ouvertes indiquent l`expression pré-immunisation (pre) et l`expression des barres remplies après le cinquième Boost (5B). Le nombre de lapins est montré sur l`axe x. L`axe y indique l`expression relative moyenne des gènes testés normalisés par rapport à la valeur la plus basse définie à 1. Augmentation de l`expression de l`ARNm relative moyenne de i) B2M et II) PAK1 après le 5e coup de pouce chez les lapins SM34 et SM35. B.

données additionnelles montrant des augmentations de l`expression de l`ARNm relative moyenne de i) B2M et II) PAK1 chez les lapins étudiés ultérieurement (31). Pour les études de validation de l`expression des gènes d`intérêt identifiés dans les études de microarray, la RT-PCR quantitative a été réalisée à l`aide d`ABI Prism 7900. L`ARN total extrait des globules blancs des lapins a été converti en cDNA du premier brin. Brièvement, on a ajouté 1 μg d`ARN total à un mélange réactionnel de 20 μL composé de 0,5 μg d`amorces aléatoires (Invitrogen, Carlsbad, CA) et d`eau sans RNase. Le mélange réactionnel a été incubé à 65 ° c pendant 5 min, puis rapidement refroidi sur glace pendant 5 min. Pour le mélange réactionnel, 4 μl de 5 × tampon de premier brin (Invitrogen, Carlsbad, ca), 1 μl de 10 mm de mélange dNTP (Invitrogen) et 1 μl de 0,1 M de le dithiothréitol (Invitrogen) a été ajouté et incubé à 25 ° c pendant 2 min. Après cette unité de SuperScript II (Invitrogen), on a ajouté le mélange réactionnel à 25 ° c pendant 10 min, suivi de 42 ° c pendant 50 min, et finalement chauffé à 70 ° c pendant 15 min, puis réfrigéré sur glace. Deux unités de RNase H (Invitrogen) sans DNase ont été ajoutées au mélange qui a été incubé à 37 ° c pendant 20 min pour enlever le gabarit d`ARN d`origine. La RNase H a été inactivée en chauffant le mélange réactionnel à 70 ° c pendant 10 min. Tous les échantillons d`ADNc ont été stockés à − 80 ° c jusqu`à ce que les analyses RT-PCR aient été effectuées. L`analyse RT-PCR des mRNA a été effectuée sur un système de détection de séquences 7900HT (Biosystems appliqués). L`ADNc synthétisé à partir d`un PWBCs isolé a été directement utilisé comme modèle pour la PCR en temps réel en utilisant le kit de réactifs de mélange Master Mix (Biosystems) de TaqMan 2x PCR.

Les amorces, les sondes et les conditions de PCR utilisées sont indiquées dans le tableau II. Chaque échantillon de trois expériences indépendantes a été exécuté en double exemplaire. Le numéro d`unité montrant les niveaux relatifs d`ARNm dans chaque échantillon a été déterminé comme une valeur de mRNA normalisée par rapport à peptidylprolyl isomérase a (PPIA). Les données RT-PCR ont été analysées à l`aide de la méthode 2 − ΔΔCT décrite par livak et Schmittgen (36). Sur la base de son expression uniforme parmi les groupes de lapins dans l`analyse par microarray, le lapin peptidylprolyl isomérase a (PPIA; cyclophiline a) a été choisi comme contrôle du gène ménager et utilisé pour le calcul du δct. Lorsque les séquences de lapins n`étaient pas disponibles, les amorces ont été conçues après avoir recherché des séquences de lapins avec des séquences génétiques humaines correspondantes dans la base de données contenant les Archives de traces de la séquence du fusil de chasse du génome entier du lapin (Oryctolagus générés par le Broad Institute du MIT et l`Université de Harvard (NCBI trace Archive: Cross-espèces Megablast à http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/tracemb.shtml) et dans les assemblages d`échafaudages de lapins à ensembl et UCSC (voir les liens sur le génome du lapin NCBI Site ressources: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/rabbit/. Il n`y a pas de «dernière» séquence dans la série s (n), mais nous voyons qu`une séquence unique d`infiniment beaucoup de 0 et de 1 est définie par ce processus et est celle que nous appelons la séquence de lapin de Fibonacci ou la séquence d`or. Les différences entre l`élément de plancher sur un la rangée et la suivante produisent la séquence de lapin: nous remplacerons 2 par M et 1 par N dans la table multiple de Phi et nous remplacerons 1 par M et 0 par N dans la table multiple de Phi.

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